I.

저선량 방사선에 노출된 유전자 발현 프로파일에서 선량 반응성 탐색

Finding Dose Responsiveness in Gene Expression Profile Exposed to Low Dose Radiation

Young-Ji Na1, Young-Woo Jin2, Young-Ju, Lee1, Ju-Han Kim, Ph.D1,3*

1Seoul National University Biomedical Informatics (SNUBI), 3Human Genome Research Institute, Seoul National University College of Medicine Seoul 110-799, yjna01@snu.ac.kr

2Division of Radiation Effect Research, Radiation Health Research Institute of KHNP, Seoul 132-703, Korea

*correspondence to juhan@snu.ac.kr

Abstract: There has been growing concern about hazardous effects caused by low dose ionizing radiation (IR). This concern is derived from the linear non threshold (LNT) hypothesis. The LNT means that the risk of a radiation increases in proportion to the dose, even in low doses. Functional insight into expression profiles is routinely obtained by using Gene Ontology(GO) terms associated to the cellular genes. In this paper, we deal with functional data mining from expression profiles, proposing an approach that studies the correlations between genes and their relations to GO terms. By using this functional correlations comparison we explore all possible pairs of genes identifying the affected biological processes.

Keyword: low dose radiation, gene expression profile, mesenchymal stem cell, microarray, dose response, time effect

배 경

방사선 피폭과 암 발생의 상관관계, 특히 고선량 피폭에 대해서는 선량과 발암성의 선형적 상관관계가 정립되어 있는데, 이것은 주로 일본 원폭 생존자 역학 연구 결과로부터 나온 것이다[1]. 고선량률로 0.1 Gy 이상 피폭을 받은 집단에서 암발생률이 증가되고 그 증가 정도 역시 선량에 비례하다는 것이 밝혀진 바 있다. 낮은 선량에서도 선량과 발암성 사이의 선형적 상관관계가 있을 것으로 판단하여, 관측치를 고선량으로부터 외삽 해석한 것을 "선형 무역치 모델(linear non threshold model; LNT)"이라고 한다[2]. 방사선 영향 국제 과학 위원회(UNSCEAR, United Nations Scientific Committee on Effects of Atomic Radiation) 등의 국제 기구들은 “실제 과학적으로 증명할 수는 없지만 사람의 방어를 위해 보수적인 관점에서 이 모형”의 적용이 필요하다고 주장하고 있다[3,4].

최근에는 저선량의 생물학적 영향 연구에서 기존의 선형 무역치에 대한 새로운 패러다임 논의가 활발히 이루어지고 있다[5]. 실제 저선량 영역에서는 특정 역치를 가지거나 인체에 긍정적 영향을 준다는 등 매우 상반된 결과들이 보고되고 있다. 특히 Luckey는 세포 실험, 동물 실험, 역학 조사 등의 다양한 자료를 통해 저선량 방사선이 인체 면역 기능의 활성화, 손상 복구 기능 증가 등을 통해 세포 증식의 증가, 암 발생의 감소, 수명 증가 등의 긍정적 영향을 끼친다는 결과를 발표했다. 이러한 인체 긍정적 영향은 ‘방사선 호메시스’ 가설로 제안되었다. 이외에도 동물이나 세포 실험을 고선량 방사선을 처리하기 전에 저선량 방사선을 미리 처리하면 세포 사멸 또는 손상이 단일 고선량 방사선 처리군에 비해 줄어든다는 방사선 적응 반응이 폭넓은 실험을 통해 사실로 받아들여지고 있다.

현재까지 방사선 등 독성 물질에 의한 유전자 발현 연구는 주로 단일 표적 유전자의 구조-기능 변이 연구에 그쳐, 분자론적 규명이 충분치 않았다. 실제 방사선 조사에 직접 반응하는 유전 물질은 적어도 수백-수천에 이를 것으로 추론되기 때문에 개별 유전자 연구만으로 방사선 반응을 이해하기에는 한계가 있다. 따라서 저선량에서의 선형 무역치를 적용하는 것이 적합한지를 판단하기 위해서는 대용량의 유전자 발현 프로파일을 통한 분자유전체학적 접근이 필요하다[6-8].

본 연구에서는 인간 기원 간엽 줄기 세포주에서 올리고 염기 유전자칩을 이용하여 방사선 조사에 따른 분자유전체학적 변화의 평가를 시행하였다. 저선량 범위에서의 유전체 발현이 각 선량마다 특정 생물학적인 기능으로 어떻게 구분될 수 있는지를 제시하였다. 즉 선량별 생물학적 기능의 비교를 통해 저선량에서 방사선에 반응하는 메커니즘이 직선가설에 부합하는지를 살펴보도록 한다.

II. 방 법

1.  인간 간엽 줄기 세포주 배양

본 연구에서는 아주대학교로부터 분양받은 인간 간엽 줄기 세포주인 B10을 이용하였다. 이 세포주는 15주 된 태아의 골수에서 적출하여 v-myc로 불멸화시켜 확립되었다.

2.  실험 설계와 방사선 조사

방사선 조사기 IBL 437C(CIS Bio-International, 선량률 50 cGy/min)를 이용하여 0(control point), 1, 5, 20, 100 cGy로 방사선 조사를 실시하였다. 방사선 노출 이후 1, 4, 12, 48 시간에 RNA를 추출하였다. 각 실험은 통계적 신뢰도를 높이기 위해 3회씩 반복되었다.

3.  마이크로어레이 실험

Table 1. Distribution of gene ontology term at each dose condition

Dose	Gene Ontology term	Dose	Gene Ontology term
1cGy	branched chain family amino acid metabolism cell motility cellular catabolism cellular macromolecule catabolism central nervous system development DNA repair enzyme linked receptor protein signaling pathway humoral defense mechanism (sensu Vertebrata) humoral immune response localization of cell locomotion monovalent inorganic cation transport negative regulation of cellular metabolism negative regulation of nucleobase, nucleoside, nucleotide and nucleic acid metabolism negative regulation of transcription negative regulation of transcription, DNA-dependent nuclear transport nucleocytoplasmic transport response to DNA damage stimulus response to endogenous stimulus sensory perception of light stimulus skeletal development visual perceptioncellular catabolism	5cGy	amino acid activation cell growth cell homeostasis cellular morphogenesis cyclic-nucleotide-mediated signaling fatty acid metabolism G-protein signaling, coupled to cyclic nucleotide second messenger growth homeostasis negative regulation of cell proliferation organ morphogenesis regulation of cell growth regulation of cell size regulation of growth tRNA aminoacylation tRNA aminoacylation for protein translation tRNA metabolism
20cGy	cholesterol metabolism di-, tri-valent inorganic cation transport inflammatory response nucleotide biosynthesis oxygen and reactive oxygen species metabolism purine nucleotide biosynthesis purine nucleotide metabolism purine ribonucleotide biosynthesis purine ribonucleotide metabolism regulation of transcription from RNA polymerase II promoter response to oxidative stress response to wounding ribonucleotide biosynthesis ribonucleotide metabolism steroid metabolism sterol metabolism	100cGy	regulation of enzyme activity small GTPase mediated signal transduction

대조군은 방사선 비조사 세포군으로써 기준시간 0, 선량 0인 샘플을 이용하였다. 대조군은 Cy3, 실험군은 Cy5 형광염료로 표식하였다. 실험군과 대조군에 각각 형광 표지된 cRNA는 분절화한 뒤 올리고칩(10,418 probes)에 24시간 동안 교합시켰다. 영상처리 및 데이터 획득은 스캔한 뒤 GenePix 4.0 소프트웨어를 이용하였다.

4. 상관 분석

특정 선량 내에서 pair-wise 방식으로 Pearson's correlation coefficient를 구하였다. 구한 값의 significance level을 계산하여 p value < 1.0 × 10-5인 유의한 gene pair를 본 연구에 사용하였다.

5. 유전자 의미 분석

유전자의 생물학적인 의미 분석을 위해 gene products에 specific term을 제공하는 Gene Ontology (GO) consortium (http://www.geneontology.org/) 의 GO term을 사용하였다.

III. 결 과

각 선량 내에서 correlated gene pair를 구했을 때, 1cGy에서는 1300, 5cGy에서는 749, 20cGy에서는 596, 100cGy에서는 632 개의 pair를 추출하였다. 상관 분석에서 동일한 p value(< 1.0 × 10-5)를 적용했음에도 불구하고 correlated gene pair의 분포에 차이가 존재한다. 가장 낮은 선량인 1cGy에서 correlated gene pair가 가장 많았다. 20cGy와 100cGy에서는 오히려 20cGy에서 correlated gene pair가 더 적었다. 이것은 방사선에 노출되었을 때, 가장 낮은 선량에서 방사선 자극에 대한 민감도가 오히려 높음을 유전자 발현의 양적 변화를 통해 알 수 있다. 그리고 20cGy와 100cGy에서 correlated gene pair의 분포가 선형적이지 않은 것은 방사선 반응이 직선적이지 않음을 간접적으로 시사한다고 할 수 있다. 각 gene pair가 공통적으로 가지는 GO term을 추출했을 때도 1cGy에서 23개, 5cGy에서 17개, 20cGy에서 16개, 100cGy에서 2개로 1cGy에서 가장 많은 GO term 결과를 얻었다.

1cGy에서 humoral defense mechanism, humoral immune response 및 DNA repair, response to DNA damage stimulus, response to endogenous stimulus가 추출되었다. 이로써, 극미량의 방사선에 노출될 때부터 면역 기작이 활성화될 뿐 아니라 DNA 손상에 대한 복구 시스템이 동작하기 시작할 것임을 추측할 수 있다. 그리고 cellular metabolism과 nucleobase, nucleoside, nucleotide, nucleic acid metabolism 및 transcription에 대해 negative regulation하는 term들이 존재한다. 즉 방사선이라는 외부 자극에 대해, 기본적인 세포 활동에 해당하는 metabolism, transcription이 일시적으로 정지하고 자극에 대한 방어 태세를 갖춘다고 볼 수 있다.

5cGy에서는 cell growth 및 cell size에 관여하는 기능들을 찾을 수 있었다. 반면에 cell proliferation에 대해서는 negative regulation을 하였다. 이것은 5 cGy 정도의 방사선 자극에 대해 세포 증식은 억제하되 세포 활동은 유지하는 차원의 반응을 보인다고 할 수 있다. 만약 LNT가 적용된다면 방사선 자극이 주어지는 시점부터 생체 반응은 세포 고사나 죽음과 관련된 기작이 관여되었을 것이다. 그러나 5cGy에 대해 기본적인 세포 활동이 유지되는 것을 볼 때 LNT 적용이 적합하지 않을 수도 있음을 암시한다고 할 수 있다.

20cGy에서는 purine의 biosynthesis, metabolism 및 steroid의 metabolism에 관여하는 유전자들이 발현되었다. 5cGy의 결과에서처럼 세포 유지적인 측면과 관계가 깊다. 뿐만 아니라 inflammatory response, response to wounding, response to oxidative stress와 같은 기능의 term을 추출하였다. 즉 방사선의 생물학적 효과가 입사방사선과 생물체를 구성하는 원자와의 상호작용결과 발생하는 전리현상으로 설명됨을 입증하는 GO term 결과를 획득한 것이다. 세포는 대부분 물로 구성되어 있어서 방사선이 입사되었을 때 DNA보다는 오히려 물과 반응할 확률이 훨씬 높다. 방사선이 물과 반응하여 결과적으로 oxidative stress를 일으키므로 그에 상응하는 세포 활동이 개시된 것이다.

100cGy에서는 다른 선량에 비해 correlated gene pair의 개수가 작을 뿐 아니라 추출된 gene pair에서 유의하게(p value < 1.0 × 10-5) 공통적으로 가지는 GO term의 개수 역시 현저히 작았다. 이는 선량이 커질수록 유전자 사이의 co-regulation 관계가 유지되지 않음을 단적으로 보여준다. 100cGy에서 correlated gene pair들이 매핑된 GO term으로는 regulation of enzyme activity, small GTPase mediated signal transduction이 있다.

IV. 결 론

본 연구에서는 저선량 방사선에 대한 생체 반응이 고선량 방사선 노출 결과로부터 외삽될 수 있는지를 특정 선량 내 correlated genes의 biological process term을 통해 살펴보았다.

선량이 증가할수록 correlated gene pair의 개수가 감소하는 것을 통해 선량이 증가하면 대체적으로 co-regulation 관계가 유지되기 어렵다는 것을 알 수 있었다.

특정 선량에서만 유의한 GO term을 추출하는 작업을 통해 선량 별 correlated gene pair의 GO term을 분명히 구별할 수 있었다. 결과의 내용을 간략히 요약하면 다음과 같다.

(1) 1cGy는 면역 반응 및 DNA 손상 복구 시스템과 관련 있고 기본적인 세포 활동에 대해서는 일시 정지 상태에 있음을 확인했다.

(2) 5cGy에서는 방사선이라는 외부 자극에 대해 세포 증식은 억제하되 세포 활동은 유지하는 차원의 반응을 보인다고 할 수 있다.

(3) 20cGy는 5cGy와 같이 biosynthesis 및 metabolism에 관여할 뿐 아니라 외부 스트레스 자극에 대한 반응과 관련되어 있다. 즉, 20cGy에서 방사선에 대한 반응이 시작되고 선량이 1Gy에 도달하게 되면 세포가 손상이 심하게 되어 회복이 불가능 한 세포는 아폽토시스 기전을 밟는다는 것을 짐작할 수 있다.

(4) 100cGy에서는 co-regulation 되는 gene pair가 현저히 감소하는 것을 통해 선량이 증가함에 따라 유전자 상호 관계가 교란됨을 알 수 있다.

향후 저선량 방사선 반응에 대한 유전자 상호 관계를 통한 시스템 측면에서의 접근이 필요함을 확인하는 계기가 되었다. 뿐만 아니라 방사선 선량과 조사 후 시간의 경과에 따른 세포신호전달계와 관련된 유전단백체의 변환과 상관하여 종합적인 해석이 필요하다고 본다.

아직까지 본 연구에 이용한 중배엽 줄기세포를 포함한 사람의 신체를 구성하는 세포들의 방사선에 대한 반응기전에 대해서는 분명하게 밝혀진 것은 없다. 림파구들의 방사선에 대한 감수성을 비교한 기존의 보고들을 종합하여 볼 때, 세포 활성도, 아폽토시스 그리고 증식능력 등에 있어서 차이를 보이고 있어서 [9,10], 중배엽 세포의 자체 회복증력과 연결하여 확대 연구가 필요할 것 같다.

감사의 글

This study was supported by a grant from Ministry of Science and Technology, Republic of Korea (2005-00162).

참고문헌

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2. Mitchell SA, Marino SA, Brenner DJ, Hall EJ: Bystander effect and adaptive response in C3H 10T1/2 cells. Int. J. Radiat. Biol. vol. 80, no. 7, 465-472, 2004

3. ICRP. Recommendations of the International Commission on Radiological Protection. International Commission on Radiological Protection Publ 1. London: Pergamon Press, 1959.

4. ICRP. Principles for Limiting Exposure of the Public to Natural Sources of Radiation. Statement from the 1983 WashingtonMeeting of the ICRP. International Commission on Radiological Protection Publ 39. Oxford: Pergamon Press, 1984

5. William M. Bonner: Low-dose radiation: Thresholds, bystander effects, and adaptive responses. PNAS, vol. 100, no. 9, 4973-4975, 2003

6. Schena M, Shalon D, Davis RW and Brown PO: Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science 270: 467470, 1995.

7. Schena, M, Shalon, D, Heller R., Chai A, Brown PO, and Davis RW: Parallel human genome analysis: microarray-based expression monitoring of 1000 genes. Proc Natl Acad Sci, 93: 1061410619, 1996.

8. DeRisi, J, Penland, L, Brown PO, et al.: Use of a cDNA microarray to analyse gene expression patterns in human cancer. Nat. Genet., 14: 457460, 1996.

9. Holmen A, Karlsson A, Bratt I, Hogstedt B. : Micronuclei and mitotic index in B-, T4- and T8-cells treated with mitomycin C and gamma-irradiation. Mutat Res. Aug 309(1):93-99, 1994

10, Hogstedt B, Karlsson A, Bratt I, Holmen A. : Micronucleus induction in human B and T lymphocytes separated by an immunomagnetic technique. Hereditas. 19(2):99-103, 1993